4. 准备70c温浴。
5. 使用前检查buffer bL 是否有沉淀析出,若出现沉淀,请于70c温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
完成试剂准备工作之后,在钟教授的首肯之下,研究员开始进行dNA的提取。
具体操作步骤如下:
1. 向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。
2. 加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。
~undefined 若全血样品体积少于200 ul,用pbS 补充到200 ul。
~undefined 若样品为鸟类血,样品用量须低于10 ul。
~undefined 若需得到RNA-free 的基因组dNA,在步骤3 加入buffer bL 前加入dNase-free 的RNase A(20 mg\\/ ml) 。
3. 加200 ul buffer bL ,注意不要打湿每孔的边缘,用96 圆孔硅胶片密封各孔。
4. 用力混合30 s。
5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3000rpm后即停止。
6. 在培养箱或烘箱中70c温浴至少10 min。
7. 3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000rpm后即停止。
8. 取下96 圆孔硅胶片,每孔加入200 ul 乙醇(96-100%)。
9. 用96 圆孔硅胶片密封各孔,用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000 rpm 后即停止。
10. 将96 孔dNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片,将每孔中的溶液转移至96 孔dNA 板 中,6 000 rpm 离心4 min。
11. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔dNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入500 ul buffer w1b,用一新的bF-400 膜密封96 孔dNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
~undefined 确认在buffer w1b trate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
12. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔dNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入850 ul buffer w2,用另一新 的bF-400膜密封96孔dNA板,6 000 rpm 离心4 min。
~undefined 确认在buffer w2 trate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
13. 弃滤液,将96孔dNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入400 ul buffer w2, 用另一新的bF-400 膜密封96 孔dNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
14. 将96孔dNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,用bF-400膜密封96孔dNA板,6 000 rpm离心15 min。
15. 将96孔dNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入100-200 ul Eluent b 或去离子水,室温静置2 min,用另一新的bF-400膜密封96 孔dNA板,6 000 rpm 离心4min洗脱得到dNA。
看着最终提取出来的dNA样本,钟教授终于露出了满意的微笑......', '.')